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羊克隆抗体是怎么来的?

2022-01-05 15:44 阅读次数:

单克.隆抗体是由单一B细胞克.隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克.隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融.合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融.合为B细胞杂交瘤。 用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群,可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克.隆抗体。
 
制备过程
 
1. 免.疫动物
 
免.疫动物是用目的抗原免.疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋.巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠,按照预先制定的免.疫方案进行免.疫注射。 抗原通过血液循环或淋.巴循环进入外周免.疫器.官,刺.激相应B淋.巴细胞克.隆,使其活.化、增殖,并分化成为致敏B淋.巴细胞。
 
2.细胞融.合
 
采用二氧化碳气体处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨,制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并加入促融.合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋.巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融.合,形成杂交瘤细胞。
 
3.选择性培养
 
选择性培养的目的是筛选融.合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中,未融.合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融.合的淋.巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融.合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖。
 
4.杂交瘤阳性克.隆的筛选与克.隆化
 
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克。隆抗体的细胞,因此,要进行筛选和克.隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克.隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免.疫学方法,筛选出能产生所需单克.隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克.隆扩增。经过鉴定其所分泌单克.隆抗体的免.疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存。
 
5.单克.隆抗体的大量制备
 
单克.隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
 
(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后,腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖,并产生和分泌单克.隆抗体。约1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克.隆抗体。
 
(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克.隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克.隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现,大大提高了抗体的生产量。